Bis-Tris Western Blots: По-остра алтернатива за откриване на протеини

By | октомври 17, 2020

Уестърн блотингът е най-често срещаният анализ за измерване на нивата на протеин от клетките и тъканите. Стандартното Western blotting започва с разтворими протеини в детергент-съдържащ буфер. Обикновено тези протеини ще бъдат денатурирани чрез кипене и редуциращи агенти (например бета-меркаптоетанол). Bis-tris уестърните започват по същия начин и всъщност са напълно идентични с обикновените уестърн петна, с няколко големи изключения.

Първият е буферът, използван за направата на геловете различни. Както може би се досещате от името му, бис-трис-геловете използват бис-трис-НС1 буфер, докато традиционните уестърн петна използват стандартен трис-НС1 буфер. Втората разлика е, че гелът за подреждане и гел разтворът използват един и същ буфер по време на бистрис уестърн блотинг. При стандартни приложения гелът за подреждане е кисел (pH 6,8), а гелът за разтваряне е основен (pH 8,8). За бис-трис западните стойности целият гел се пуска в киселинни условия при рН 6.8.

Киселинните условия в бистрис западните гостоприемници благоприятстват повторното окисляване на протеини по време на електрофореза. За да се компенсира този проблем, редуциращ агент (натриев бисулфит) се добавя към работещия буфер при концентрация 2.5 тМ. И накрая, последната голяма разлика е в състава на работещия буфер. За бис-трис уестърните използвайте MOPS-SDS работен буфер, за разлика от традиционния трис-глицинов SDS буфер за стандартно уестърн блотинг.

Обща разбивка на бис-уестърн протокола ще бъде както следва:

  • Налейте вашите гелове с бис-трис HCl рН 6.8 буфер при желаната концентрация на акриламид (6-15%). Най-добре е да направите това вечерта, преди да планирате да пуснете гела си. Най-добри резултати се получават, когато оставите гела да се полимеризира за една нощ при 4 градуса по Целзий.
  • Сварете и денатурирайте вашите проби.
  • Допълнете MOPS-SDS работещ буфер, съдържащ 2.5 mM натриев бисулфит. Добавете бисулфит пресен преди шофиране.
  • Пуснете гела при постоянно напрежение 100V за около два часа. Времето за работа варира в зависимост от концентрацията на гела.
  • След като се постигне желаната разделителна способност, прехвърлете гела върху мембрана, използвайки традиционния буфер за пренос на трис-глицин SDS с 20% метанол.
  • Оставете гела да престои в трансферния буфер за 10 минути преди полусух трансфер, така че буферираният с MOPS гел да балансира с трансферния буфер.
  • Прехвърлете при 15V за 45 минути в гелове с дебелина 1 mm.
  • Когато прехвърлянето завърши, блокирайте мембраната или с 5% говежди серумен албумин в разтвор, буфериран с трис-20 (TBST), или с 5% мляко в TBST за два часа.
  • Инкубирайте с първичното антитяло за още четири часа през нощта
  • Измийте първичното антитяло и инкубирайте с конюгирано с пероксидаза хрян вторично антитяло за един час.
  • Измийте вторичното антитяло, потопете Western blot в подобрен реактив за хемилуминесценция и го изложете на филм.

Bis-tris уестърните са много надеждни и възпроизводими. Следователно, те ви спестяват много неудовлетвореност, време и производителност благодарение на тяхната превъзходна консистенция в сравнение с обикновените уестърн петна.

Вашият коментар

Вашият имейл адрес няма да бъде публикуван. Задължителните полета са отбелязани с *